凍干保護劑 ▏蛋白凍干保護劑在冷凍干燥過程中起到作用

       四環冷凍干燥機廣泛用于制備治療性蛋白質制劑，蛋白凍干制劑可以提供更好的保質期，方便藥物的儲藏和運輸。然而，蛋白在凍干過程中存在許多應力，包括低溫應力、凍結應力(枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變、相分離等)、干燥應力(失去蛋白質表面水分子)等，這些應力常常直接或間接導致蛋白質類藥物失去天然構象從而變性或失活。所以即使采用了冷凍干燥這種溫和的干燥方式，還需要加入合適的凍干保護劑以很好的保護蛋白穩定性。

       冷凍干燥保護劑對于蛋白質的保護原理已經被研究討論了幾十年，形成了一些被普遍接受的共識。如在凍結階段，主要的假說為“優先化作用”;在干燥階段主要的有2種假說，即“玻璃化”和“水置換”。

      冷凍干燥保護劑的分類方式很多，有文獻中提出了一個公式化模型，按照功能把冷凍干燥保護劑分類，包括5類: ①pH緩沖劑，如Tris、組氨酸、枸櫞酸等;②配體，可以優化蛋白質的熱力學穩定性;③穩定劑，一般是雙糖，如蔗糖、海藻糖等，可通過抑制蛋白質的展開和提供玻璃基質起保護作用;④非離子表面活性劑，可減少蛋白質的聚集;⑤填充劑，如甘露醇、甘氨酸、羥乙基淀粉、血清白蛋白等，可提高產品的物理成型性。這里我們簡要介紹其中幾種。

      為了保證冷凍干燥后形成良好的配方結構防止產品塌陷，同時改善配方溶解性，冷凍干燥保護劑中還需要加入填充劑。首先，填充劑在復溶時應該是充分可溶的并且與制劑中的蛋白質藥物相容。此外，它們沒有毒性問題并且具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可有效提高冷凍干燥效率。

        甘氨酸和甘露醇經常用作凍干蛋白質制劑的填充劑。甘氨酸在用作填充劑時具有優勢，因為它是無毒的。它具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可實現高效冷凍干燥和高溶解度。

      甘露醇具有與甘氨酸相同的優點，并且對特定蛋白質藥物如LDH和轉化生長因子-b1具有穩定作用，其穩定效果取決于其濃度。因此，在選擇填充劑時，應仔細考慮穩定效果以及粉餅外觀。大多數氨基酸容易結晶并且可以潛在地用作填充劑以穩定蛋白質，然而，酸鹽的形成阻礙了它們的結晶。 NaCl是另一種結晶劑，但其共熔溫度(Teu)相對于其他填充劑的而言太低，因此不推薦使用。

      對于填充劑，應考慮退火步驟。甘氨酸和甘露糖醇在冷凍干燥過程中應以結晶形式存在。 但是在冷凍步驟期間，過冷卻誘導兩種填充劑以無定形形態凍結，容易導致粉餅塌陷。另外，在沒有退火的情況下，填充劑可以在初級干燥期間重結晶造成西林瓶破裂，特別是當制劑中包含高濃度的甘露醇時。填充劑應在非晶相的玻璃化轉變溫度(Tg’)和填充劑的共熔溫度(Teu)之間進行有效結晶，而退火時間取決于填充劑濃度及其性質。 對于甘露醇和甘氨酸，填充高度在1cm時，推薦在-20或-25℃和2小時。

      多元醇廣泛用于蛋白質穩定劑，因為它們可以通過其羥基穩定蛋白質。多元醇已被用作冷凍保護劑和凍干保護劑。例如，在凍融期間，LDH在不同程度上受甘油，木糖醇，山梨糖醇和甘露醇的保護。

      聚合物已被用作蛋白質溶液和凍干制劑的保護劑。血清白蛋白是用于蛋白質藥物開發的廣泛使用的聚合物之一，作為凍干保護劑和冷凍保護劑。許多上市蛋白質藥物含有不同量的白蛋白(表1)。但是，血清白蛋白具有與血源性病原體相關的潛在污染物，限制了其在蛋白質藥物制劑中的使用。因此，建議rHA替代血清白蛋白。終，建議在沒有白蛋白的情況下開發蛋白質藥物。

      在冷凍步驟中，形成冰水界面可能導致蛋白質表面變性。表面活性劑降低蛋白質溶液的表面張力，保護其免受表面變性。廣泛使用的表面活性劑之一是Tween 80。