四環凍干機—真空冷凍干燥特性參數測量與分析（二）

凍干過程的分析與觀察

Hsu等將重組CD4-IgG(CD4-免疫球蛋白G)用四級串聯的帕耳帖組件冷卻至-60℃，用一架低溫顯微鏡觀察到了它的再結晶過程。他的觀察室也可以被抽成真空而用于冷凍干燥研究。

圖4-17中，(a)是快速冷卻過程中，約在-24℃時樣品的照片，(b)是第一次從-54℃加熱到約-36℃的照片，(c)是再次被冷卻到-54℃時的照片。在圖(a)中，大部分晶體（顏色較深處）均勻地分布在濃縮的非晶固體（顏色較亮處）中間。在圖(b)中，晶體有所生長，濃縮物中的水分也已經結晶。在圖（c）中，晶體與玻璃狀雜質的邊界清晰可見，特別是在圖中右上角更明顯。圖4-18所示的是在一些具有可比性的溫度下，樣品另外的一個部分，即靠近樣品邊界的顯微照片：(a)約在-23℃，(b)第一次加熱時，約在-30℃，(c)再次冷卻到-60℃。圖(b)中，晶體已有所生長，但其大致結構沒有太大的變化，特別是在圖的左上角部分。在圖(c)中，晶體與玻璃狀物質的邊界更加清晰。圖4-18所示的是樣品的第三部分：(a)冷卻到一65℃之后的照片，(b)熱處理后，再次冷卻到-60℃，然后在-40℃開始凍干。同樣，熱處理并未使整體結構有所改變，但是晶體結構更加清晰，這表明玻璃相和晶體之間的水分子已經遷移到晶體中。圖4-17~圖4-19中的照片說明，快速冷卻不能使整個樣品的各個部分形成均勻的組織結構，因為它會受到邊界效應的影響。但是，在樣品的所有部分都觀察到了熱處理的影響。圖4-20所示的是，從冷卻結束溫度（-60℃)上升到開始干燥溫度（-42℃）時，不經熱處理對晶體生長的影響。值得注意的是，在自動向低溫擱板上裝載產品時出現的現象。第一次裝載藥瓶中的產品與后來裝載的，例如2~3h后裝載的，產品有不同的結構。

低溫顯微鏡研究的優點是有可以顯示樣品組織結構變化過程的照片，而且，凍結的產品可以在大多數的設備中被冷凍干燥。產品層很薄，因此可以被迅速冷凍。所以，產品在復溫和干燥過程中所表現出的性狀特征與快速冷凍過程的相一致。因為產品層很薄，故模擬熱處理的過程很困難。然而，實驗表明，從此項研究中獲得的臨界溫度是有價值的，特別是獲得冷凍速率相對緩慢時產品的電阻值。

Nunnerf使用一臺特殊的低溫顯微鏡拍攝到了0.9%的NaCl溶液在360s內直接冷凍到穩定樹枝狀冰晶結構的過程中冰晶邊界面變化的照片（如圖421）。在冰晶的表面可見因濃縮而集中起來的NaCI(黑色邊界)。

Cosman等人描述了一臺可以定量評價照片的低溫顯微鏡，該裝置有如下四個顯著特點：

①溫度的產生、測量和控制是由程序控制的;

②顯微照片可以存檔，以備后用；

③文檔可部分地用于自動圖像識別;

④如果冷凍過程可以用數學的方法描述，而且細胞的行為可以預測，則用上述方法可以減少數據量。

圖4-22表示的低溫顯微鏡系統的布置圖。通過使用熱傳導性非常優良的藍寶石觀察窗和使用液氮冷卻系統，作者實現了以每分鐘冷卻速率冷卻到一60℃，而且在溫度為0℃時，樣品內的溫度梯度達到了0.1℃/mm。

下面用三個例子來說明使用這種顯微鏡系統如何進行冷凍過程的定量研究和存檔。圖4-23表示的是被分離的老鼠胰島細胞的體積與溫度的函數關系曲線。如圖4-24所示，細胞膜對水和CPA的滲透性的不同對細胞的冷凍是非常重要的。

將獼猴卵母細胞置入體積分數10%的二甲基亞砜溶液(DMSO)后其體積幾乎減少到原來的三分之一，這是因為水能從細胞里擴散到周圍環境中去，而二甲基亞砜卻不能擴散到細胞內（測量溫度為23℃）。

細胞損壞的原因在于細胞內冰晶成核。圖4-25表示在不同冷卻速率下，有多少老鼠卵母細胞內發現胞內冰與溫度之間的函數關系曲線。老鼠肝細胞在以大約40℃/min的速率冷卻到-21℃的過程中沒有發現胞內冰，然而，當以140℃/min速率冷卻時幾乎所有的細胞內都存在冰，這是因為水沒有足夠的時間擴散到周圍環境就被凍結在細胞內。圖4-25也說明細胞內冰晶成核是由絕對溫度和冷卻速率決定的：在大約-25℃，以5℃/min速率冷卻幾乎所有的細胞內都有冰，然而，以3.5℃/min速率冷卻，大約20%的細胞內沒有冰。

Dawson和Hockley利用掃描電子顯微鏡(SEM)表明了海藻糖和甘露醇溶液的快速冷凍(150℃/min)和慢速冷凍(1℃/min)時結構上的差異。圖4-26表示1%海藻糖溶液被(a)慢速和(b)快速冷凍時中心部位的表面結構。慢速冷凍樣品（c）濃縮的固體表面上產生裂縫，然而，快速冷凍的樣品的結構卻是均勻的纖維狀。圖4-27表示慢速和快速冷凍1%乳糖時其中心部位粗糙的(a)和精細的(b)結構。在圖4-28(a)中可發現海藻糖溶流崩塌的部分，圖（b)表示干燥后產品在潮濕的環境下貯存6個月以后的結構，圖片表明不同的冷凍速率導致不同的結構，且有可能使固體濃縮在表面上，在干操過程使干燥速率降低，殘余水分含量增加。