四環(huán)凍干機(jī)—生物制品和生物組織凍干技術(shù)（七）

5.3.2  大鼠皮膚吹干與凍干比較研究

10年后，西北大學(xué)的楊維也進(jìn)行了大鼠皮膚的冷凍干燥實(shí)驗(yàn)。他首先重點(diǎn)研究了濃度、孵育時(shí)間、孵育溫度對(duì)大鼠皮膚凍干保護(hù)劑海藻糖負(fù)載量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠皮膚對(duì)海藻糖的載入量的優(yōu)化條件為：海藻糖濃度800mmo1/L,孵育溫度37℃，孵育時(shí)間為7h。之后，皮膚組織分別進(jìn)行凍干和吹干。

(1)凍干  皮膚組織在37℃加載海藻糖，4℃加載DMSO，將負(fù)載了海藻糖和DMS0的皮膚塊放入凍存管內(nèi)，凍存管放入程序凍存盒，置于-80℃冰箱冷凍。12h后將冷凍的皮膚組織連同凍存管轉(zhuǎn)入預(yù)冷的凍干機(jī)，去掉凍存管蓋子。冷凍干燥機(jī)運(yùn)行狀態(tài)參數(shù)為：冷阱中溫度-45℃，冷阱上方溫度0℃左右，真空度10Pa,凍干時(shí)間設(shè)置30h。先將皮膚樣品置于冷阱中凍干24h，然后在冷阱上方凍干6h。先在冷阱中凍干是為了防止皮膚組織中固態(tài)的水分回融再結(jié)晶對(duì)組織產(chǎn)生冰晶損傷，組織中大部分游離水升華后轉(zhuǎn)冷阱上方凍干，此時(shí)溫度稍高可以進(jìn)一步除去組織內(nèi)部水分。

(2)吹干  皮膚組織在37℃、800mmol/L海藻糖培養(yǎng)液中孵育7h加載海藻糖，負(fù)載了海藻糖的皮膚用濾紙拭去表面殘留液體，表皮朝下平展于玻璃培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿敞口置于生物安全柜（打開(kāi)送風(fēng)開(kāi)關(guān)）吹干。大鼠皮膚的吹干時(shí)間設(shè)置為20～30h可以將皮膚中水分去除，玻璃化狀態(tài)良好。

經(jīng)檢測(cè)得知，剛凍干皮膚活性比剛吹干皮膚活性高1/3，保存時(shí)間延長(zhǎng)到28d，凍干組皮膚活性與剛吹干組相當(dāng)。凍干過(guò)程中，皮膚組織內(nèi)水分先在DMSO保護(hù)下逐漸凍結(jié)，放入凍干機(jī)后固態(tài)水升華，由于海藻糖取代水分子的作用，干燥過(guò)程組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和活性不會(huì)發(fā)生變化，但在吹干過(guò)程中皮膚組織內(nèi)水分由液態(tài)直接蒸發(fā)，原來(lái)包繞在細(xì)胞外的水膜以及和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的水分子可能還未被海藻糖取代就已蒸發(fā)。上述原因可能導(dǎo)致未保存的凍干皮膚活性高于吹干皮膚。干燥保存的皮膚活性開(kāi)始降低速率較快，降到一定程度后降低速率減慢，所以保存一周后凍干組和吹干組皮膚活性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

干燥保存的皮膚置于飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱37℃預(yù)水化15min后，皮膚依次用含800mmol/L和400mmol/L海藻糖的DMEM培養(yǎng)液室溫下孵育15min，用不含海藻糖的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液漂洗3次以上，清除皮膚組織中殘留的DMSO和海藻糖，最后轉(zhuǎn)入無(wú)海藻糖的DMEM培養(yǎng)液中孵育2h，進(jìn)行形態(tài)觀察。如圖5-10所示。

凍干皮膚玻璃化狀態(tài)良好，呈半透明狀。復(fù)水后能夠恢復(fù)到新鮮皮膚的大小和色澤。凍干皮膚角質(zhì)層局部受損，而組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)與新鮮皮膚組織沒(méi)有差異。將凍干后復(fù)水的皮膚移植回自體大鼠，可存活13d。

自體移植后凍干組皮膚存活時(shí)間較吹干組長(zhǎng)，可能是由于吹干過(guò)程對(duì)皮膚組織產(chǎn)生的損傷較大。凍干組皮膚在6d皮下出現(xiàn)血紅色區(qū)域可能是自體動(dòng)物在移植皮下發(fā)生血管化，但后來(lái)有兩處變成暗紅色，而其他區(qū)域血紅色減弱消失可能是血管化失敗，而吹干組未出現(xiàn)血紅色，可能根本就沒(méi)有發(fā)生血管化。

通過(guò)HE染色和透射電鏡對(duì)比分析新鮮皮膚和干燥皮膚組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。HE染色結(jié)果顯示干燥保存過(guò)程沒(méi)有明顯改變皮膚組織結(jié)構(gòu)，也未影響皮膚組織的結(jié)構(gòu)完整性。透射電鏡結(jié)果說(shuō)明干燥皮膚具有與新鮮皮膚無(wú)差別的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞外膠原結(jié)構(gòu)，同時(shí)可觀察到干燥皮膚細(xì)胞中結(jié)構(gòu)正常的線粒體和平滑的核膜等細(xì)胞器。結(jié)構(gòu)學(xué)觀察結(jié)果證明干燥保存未對(duì)皮膚組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。

通過(guò)熒光標(biāo)記和MTT活性分析研究干燥過(guò)程對(duì)皮膚活性影響。熒光標(biāo)記結(jié)果表明，除毛囊處明顯受損外凍干皮膚組織大部分區(qū)域在水化后能恢復(fù)活性。MTT活性分析結(jié)果顯示凍干和吹干皮膚仍能分別保持58%和48%的活性。